Isabel de Bobadilla nació probablemente en 1505 (Aram) o 1508 (Lalor), en Segovia, ciudad donde nacieron y vivieron sus padres y abuelos.
Era hija del noble, político y militar castellano Pedro Arias Dávila, también conocido como Pedrarias “el galán”, o “el gran justador” cuyo destacado papel en las tomas de las ciudades de Orán y Bugía justificaron que la reina Juana le concediera un blasón que distinguiría su línea genealógica de la de sus parientes. En 1514 fue nombrado gobernador y capitán general de Castilla del Oro, donde fundó Panamá, y posteriormente fue gobernador de Nicaragua (1528-1531).
Su madre era Isabel de Bobadilla y Peñalosa, sobrina de Beatriz de Bobadilla, favorita de la reina Isabel, y bajo cuyo amparo se había educado desde muy pequeña. Las historias y crónicas de la época la describen como una mujer de temperamento y ánimo “valiente e independiente y carácter firme". Su matrimonio con Pedrarias supuso la unión de fuerzas de las dos familias más relevantes de la ciudad y la solución de las disputas entre estos dos linajes, antes enfrentados.
Isabel de Bobadilla se casó en 1537 con Hernando de Soto, un ya reputado y enriquecido conquistador español, antiguo protegido de su padre, que había participado en la conquista del Perú con Pizarro, debiéndosele recordar especialmente en la conquista de Cuzco y captura de Atahualpa. La escritura de capitulaciones fue concertada por su madre con el mismo Hernando de Soto. Isabel de Bobadilla aportó a su matrimonio con Soto un total de 3.395.000 maravedís mientras este aportó 2.250.000. Gracias a sus contactos y fama, de Soto logró entrevistarse en 1537 en Valladolid con el emperador Carlos, a quien solicitó autorización para realizar una nueva expedición a La Florida, que costearía con sus propios medios y ofreciendo a la Corona la mitad de las ganancias de la empresa. Tras su matrimonio, Soto fue nombrado caballero de Santiago. El rey firmó el 20 de abril de ese mismo año la capitulación para la conquista de la Florida, y el matrimonio se trasladó entonces a Cuba, donde Hernando había sido ya nombrado gobernador.
El emperador le nombró además adelantado y capitán general de todas las tierras descubiertas. De Soto vendió gran parte de sus bienes y se equipó para realizar la expedición en aquellas tierras casi inexploradas. Su misión era conquistar, situarse, y «pacificar» los territorios desconocidos. Comprometía toda su fortuna, pero en caso de éxito, sería dueño de un inmenso territorio, prácticamente todo lo que había al norte del entonces virreinato de la Nueva España. La expedición llegó a Santiago de Cuba el 7 de junio de 1538 y en el mes de agosto partió Isabel a la Habana en barco mientras De Soto, con los oficiales y caballerías, hacían el viaje por tierra
La nobleza de Isabel, su fortuna, la protección que desde muy niño le había prestado su padre a Soto, la riqueza de su familia y las amplias y valiosas relaciones que poseía con personajes de la época, así como la belleza, inteligencia y discreción que adornaban su persona, han hecho de esta mujer una figura que se destaca con caracteres propios y relevantes junto a su marido, siendo imposible hablar de éste, ni de su gobierno en Cuba, ni de su expedición a La Florida, sin mencionar también, de manera muy singular, a Isabel de Bobadilla.
Fue Hernando de Soto el iniciador de las obras de la primitiva fortaleza habanera, que continuó su esposa durante su mandato al recibir una real cédula que le encargaba continuar la fortificación del puerto de la Habana que había comenzado su esposo. Más tarde, y al mismo tiempo que se construía la fortaleza, edificó Isabel una casa (en la que aún residía en marzo de 1544, un año y nueve meses después de fallecido su marido, y cuando se preparaba ella para regresar a España). Cuando Soto viajó a Florida en 1539, el 17 de mayo del mismo año en San Cristóbal de la Habana y ante el escribano Francisco de Alcocer dejó su cargo de gobernador del archipiélago a su esposa Isabel de Bobadilla, quien lo administró como gobernadora entre 1539 y 1544. Isabel de Bobadilla se convirtió, así, en la primera y única mujer que ostentó la máxima autoridad de la isla, durante el largo período colonial de cuatro siglos, tomando las decisiones de gobierno necesarias, incluso nombrando a las personas que desempeñaron los diferentes cargos, así como recibiendo y cumplimentando las cédulas y provisiones que le llegaban del gobierno central. Para acompañarla en su labor Soto nombró a Juan de Rojas como lugarteniente, aunque es probable que contara también con otros agentes que la aconsejaran e informaran, como es el caso de Andrés de Parada, procurador de Santiago de Cuba, como se puede apreciar en varias cartas que este le escribió a Isabel, siendo ya gobernadora.
Soto, antes de partir para La Florida, otorgó además un poder general a favor de su esposa para administrar los bienes del matrimonio y total libertad para hacer pactos y mandar a todos “los indios e naborías que tengo en estas partes”. Además de estas licencias que recibió Isabel, Soto le encomendaba la tarea de asegurar el aprovisionamiento de armas, dinero y barcos para la expedición a la Florida, lo cual llevó a cabo con toda diligencia.
Como podemos ver por la delegación de poderes con que dotó a su esposa, Hernando de Soto debía sentir una gran confianza con respecto al carácter e inteligencia de su esposa, y ella le correspondió.
Tras esperar durante años el regreso de su marido, al conocer su muerte, Isabel regresó probablemente a España junto a su familia.
Poco después de la partida de Soto a la Florida, Hernán Ponce de León denunció a Isabel de Bobadilla con objeto de sacar partido de las distintas empresas en las que había estado asociado con Soto. Hernán Ponce de León había estado asociado con Soto durante al menos 20 años. Ambos fueron sin duda grandes amigos y habían formado parte de las mismas expediciones luchando en Panamá, Nicaragua y Perú. En la denuncia, afirmaba que había entregado a Soto diez mil pesos de oro, siendo forzado a ello ante el miedo de que, si se negaba, Soto le quitase sus posesiones en Perú. Pretendía con esta denuncia que Isabel le devolviese ese dinero con la amenaza de presentar una reclamación al rey. El litigio fue largo y arduo y no se terminó en Cuba, sino que después del regreso de ambos a Castilla continuó en 1545 en las instancias judiciales del reino. Ponce de León volvió a España en 1539, cuatro meses después de la partida de Soto a Florida. Isabel Arias de Bobadilla regresó a Castilla en algún momento de 1544. Finalmente, Isabel perdió ese pleito que le costó perder la totalidad de las rentas de las sedas de Granada, que ascendían a 300.000 maravedís.
Murió en 1546.
En La Habana, en lo alto del Castillo de la Real Fuerza, fue construida una estatua de Isabel de Bobadilla, basándose en la leyenda, falsa, que relata que, tras la marcha de Soto a Florida, Isabel lo estuvo esperando en ese castillo durante años hasta que supo de su muerte, tras lo cual falleció al no ser capaz de sobreponerse al dolor que esta desgracia le produjo. Esta estatua es actualmente conocida como “La Giraldilla” y es considerado el símbolo más importante de La Habana. El almirante Juan de Bitrián y Viamonte, quien gobernó Cuba entre 1630 y 1634, ordenó su fundición en bronce. La estatua original está en el Museo de La Habana para protegerla del deterioro por su exposición al medio ambiente, siendo la del castillo una réplica.